植物乳桿菌代謝產物對產氣莢膜梭菌的影響
(湯立 好實沃生物)
北京101399
摘要：植物乳桿菌在代謝過程中產生的乳酸菌素具有安全、無毒的抑菌作用，乳酸菌素是由核糖體合成并分泌至胞外具備生物活性的多肽，當其達到一定濃度時可抑制致病菌或腐敗菌的生長，因此作為生物防腐劑廣泛應用于各種發酵食品中。本文用一株分離得到的植物乳桿菌HEW-ZW5進行發酵和抑菌研究，發現其發酵液在pH=8.0以下對產氣莢膜梭菌抑菌均達到高敏效果，在100℃高溫處理后其抑菌效果沒有明顯變化。
關鍵詞：植物乳桿菌，乳酸菌素，致病菌，產氣莢膜梭菌
產氣莢膜梭菌又稱魏氏梭菌，是一種畜禽養殖中的條件致病菌，廣泛存在于人畜的糞便、污水、土壤等地方。能分解肌肉和結締組織中的糖，產生大量氣體，導致組織嚴重氣腫，同時分泌的毒素能引起致死性，因而對畜禽養殖造成嚴重經濟損失[1]。
在乳酸菌中，最大的類群是乳桿菌屬，而其中的植物乳桿菌就是一類特別的乳酸菌，其分布廣泛，已被證實有能力在人類和其他哺乳動物的腸道中定植[2]，并具有代謝產物豐富和產酸、耐酸能力強的特點 [3]。植物乳桿菌的抗菌物質主要有機酸[4]、脂肪酸、短肽[5]等物質，能產生6種有機酸，包括乳酸、乙酸和丙酸等，可抑制霉菌的生長。其代謝產物中乳酸菌素是由核糖體合成并分泌至胞外的一類多肽類物質，主要通過破壞病原體外膜的完整性而起到抗菌作用[6]，
本文利用一株分離得到的植物乳桿菌HEW-ZW5進行發酵實驗，研究發現其代謝產物在pH=8.0以下對產氣莢膜梭菌均有高敏的抑菌效果，且耐熱穩定性好，在100℃水浴處理10min后其抑制產氣莢膜梭菌的效果沒有明顯變化。
1實驗材料與方法
1.1菌種
植物乳桿菌HEW-ZW5、產氣莢膜梭菌CICC-毒素A型，由北京好實沃生物技術有限公司提供。
1.2培養基
MRS培養基（g/L）：
蛋白胨 10g 牛肉膏 10g 酵母膏 5g 葡萄糖 20g 檸檬酸氫二銨 2g
無水乙酸鈉 5g MgSO4.7H2O 0.58g MnSO4.1H2O 0.25g
K2HPO4.3H2O 2g 吐溫-80 1ml pH=7.0 115℃ 滅菌30min,
RCM培養基、TSC培養基均購自青島海博生物技術有限公司
按照廠家說明書配制，其中RCM固體培養基加1.3%瓊脂粉進行滅菌。
1.3實驗方法
1.3.1 培養皿準備
RCM固體培養基按照115℃滅菌30min，滅菌完成后倒板，板子放37℃培養箱倒置空培養48h，取出放4℃冰箱備用。
1.3.2 菌體培養過程
植物乳桿菌：取甘油管1支，用接種環劃線至MRS固體板上37℃培養48h長出單菌落，接一個單菌落于MRS 50ml液體培養基中，37℃ 130rpm培養20h，取6ml菌懸液接種于MRS 300ml液體培養基中，37℃ 130rpm培養24h。
產氣莢膜梭菌：取甘油管1支，用接種環劃線至TSC固體板上37℃厭氧培養20h長出單菌落，接一個單菌落于RCM 50ml液體培養基中，37℃ 靜置厭氧培養24h。
1.3.3 實驗過程
植物乳桿菌上清液分離及處理：
取植物乳桿菌發酵完成液加入50ml滅菌的離心管中，12000rpm 離心5min，收集離心上清液。
發酵上清耐熱穩定性處理：
將發酵上清10ml裝入無菌的試管中，將其放入不同溫度條件50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴處理10min后迅速冷卻備用。
將發酵上清10ml裝入無菌的試管中，將其放入85℃水浴處理10min、20min、30min后迅速冷卻備用。
發酵上清不同pH處理：
將發酵上清20ml裝入無菌的50ml三角瓶中，用NaOH 溶液將發酵上清液 pH 調節至 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、8.5并保持 30 min。
對產氣莢膜梭菌抑菌實驗過程：
將培養好的產氣莢膜梭菌菌懸液100ul加入到空培好的RCM固體板上，立即用涂布器涂布均勻，用滅菌的1ml藍色槍頭砸孔，加入經過同一時間不同溫度處理、同一溫度不同時間處理和不同pH處理的植物乳桿菌發酵上清200ul于每個孔中，靜置放置約1.5h后于37℃ 厭氧培養箱培養20h后觀察抑菌圈大小。
2實驗結果
2.1 同一時間不同溫度處理對產氣莢膜梭菌的影響
將植物乳桿菌發酵上清液經過50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴處理10min后，對產氣莢膜梭菌的抑菌效果見表1。
表1 不同溫度處理對抑制產氣莢膜梭菌效果的影響
|
處理溫度 |
抑菌圈大小（cm） |
抑菌效果 |
|
發酵上清原液 |
2.45 cm |
+++ |
50 ℃ 2.40 cm +++
60 ℃ 2.40 cm +++
70 ℃ 2.35 cm +++
80 ℃ 2.45 cm +++
90 ℃ 2.35 cm +++
100 ℃ 2.40 cm +++
2.2 同一溫度不同時間處理對產氣莢膜梭菌的影響
將植物乳桿菌發酵上清液經過85℃水浴處理10min、20min、30min后，對產氣莢膜梭菌的抑菌效果見表2。
表2 同一溫度不同時間處理對抑制產氣莢膜梭菌效果的影響
|
處理時間 |
抑菌圈大小（cm） |
抑菌效果 |
|
發酵上清原液 |
2.40 cm |
+++ |
10min 2.35 cm +++
20min 2.40 cm +++
30min 2.30 cm +++
2.3 不同pH處理對抑制產氣莢膜梭菌效果的影響
將植物乳桿菌發酵上清液經過pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、8.5處理30min后，對產氣莢膜梭菌抑菌效果見表3。
表3 不同pH處理對抑制產氣莢膜梭菌效果的影響
|
pH |
抑菌圈大小（cm） |
抑菌效果 |
|
發酵上清原液（3.58） |
2.45 cm |
+++ |
4.0 2.50 cm +++
5.0 2.40cm +++
6.0 2.35 cm +++
7.0 2.35 cm +++
8.0 2.30 cm +++
8.5 1.70 cm ++
3 結論
本文利用一株從植物中分離得到的植物乳桿菌進行發酵培養，分析其代謝產物中有機酸、短鏈脂肪酸、乳酸菌素等活性抑菌物質的耐熱穩定性及不同pH條件下的對產氣莢膜梭菌的抑菌效果，綜合發酵實驗數據其發酵液pH值為3.58，植物乳桿菌活性為1.5*109cfu/ml，在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴處理10min后，其發酵液上清抑制產氣莢膜梭菌的效果無明顯變化，在85℃水浴處理10min、20min、30min后，抑菌效果也沒有明顯變化，在pH 8.0以下抑制產氣莢膜梭菌的效果基本一致，均為高敏抑菌效果，其抑菌的活性物質耐熱性能比較穩定，為后續開發其價值奠定了基礎。
參考文獻
[1] 王麗麗. 豬魏氏梭菌病的防治[J]. 現代畜牧科技, 2021 (04):113-114.
[2] Butorac K, Banic M, Novak J, et al. The functional capacity of plantaricin
-producing Lactobacillus plantarum SF9C and S-layer-carrying Lactobacillus brevis SF9B to withstand gastrointestinal transit[J]. Microbial Cell Factories, 2020, 19(1) : 106.
[3] Chen P T, Hong Z S, Cheng C L, et al. Exploring fermentation strategies for enhanced lactic acid production with polyvinyl alcohol-immobilized Lactobacillus plantarum 23 using microalgae as feedstock[J]. Bioresource Technology, 2020, 308 : 123266.
[4] Reis J A, Paula A T, Casarotti S N, et al . Lactic Acid Bacteria Antimicrobial Compounds: Characteristics and Applications[J].Food Engineering Reviews, 2012, 4(2): 124-140.
[5] Hati S, Patel N, Sakure A, et al . Influence of Whey Protein Concentrate on the Production of Antibacterial Peptides Derived from Fermented Milk by Lactic Acid Bacteria[J]. InternationalJournal of Peptide Research and Therapeutics, 2017, 24(1):87-98.
[6] Khalaf H, Nakka S S, Sanden C, et al . Antibacterial effects of Lactobacillus and bacteriocin PLNC8 alphabeta on the periodontal pathogen Porphyromonas gingivalis[J]. BMC microbiology, 2016, 16(1): 188-198.
